完整RNA 的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA 分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即1):样品细胞或组织的有效破碎;2),有效地使核蛋白复合体变性;3),对内源RNA酶的有效抑制;4)有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;5),对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径,1),提取总核酸,再用氯化锂将RNA 沉淀出来;2),直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA 的丢失,目前该方法的使用频率已很低。
方法一:总RNA 的试剂盒快速提取
一些公司推出的总RNA 提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA 。该总RNA 纯化系统采用两种著名的RNA 酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA 与蛋白质分离,并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-*混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中,接着用异丙醇进行二次沉淀,随后用乙醇洗涤沉淀,即可去除所有残留的蛋白质和无机盐,而RNA 中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
一:仪器
恒温水浴,冷冻高速离心机,紫外分光光度计,取液器,电泳仪,电泳槽。
二:试剂
RNA 提取试剂盒,0.05%焦*(DEPC),75%乙醇
操作步骤
(一):细胞或组织破碎
A:微生物材料
1:发酵3-4天(或对数生长期)的菌体,离心收集菌丝体(动植物材料无需此步处理)
2:用经DEPC处理的水洗菌丝体2-3次,并尽量除去残存的水
3:加液氮充分研磨,使其成为粉末,以释放RNA
4:研磨后的样品转移至12ml变性液的容器中匀浆。
B:动植物细胞培养材料 (适用的样品量为细胞:108)
1:细胞或组织培养:按常规方法进行
2:深层悬浮培养细胞的破碎:
(1)细胞收集:含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中,4℃,3000g离心5分钟
(2)细胞洗涤:上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤,然后4℃,3000g离心5分钟,
(3)细胞破碎:在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆
3:表面培养细胞的破碎:
(1)确定培养瓶数量,使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108
(2)细胞收集:将培养液倒掉,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次,在培养瓶中加入8毫升预冷变性液,转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大。
(3)用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶,旋转,溶解细胞,再吸入第三个培养瓶,以此类推,直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次。
(4)将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中,匀浆破碎细胞。
C:植物组织破碎 (适用的样品量为0.05g组织)
(1)将600ul变性液置于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。
(2)将0.05g新鲜组织用液氮冰冻
(3)在液氮下,研磨组织块
(4)待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管中。
D:动物组织破碎 (适用的样品量为1克组织)
(1)将12毫升变性液置于50毫升离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。
(2)在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织,匀浆粉碎。
注1:研磨组织块用于RNA 提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。
2:变性液及相应的离心管需预冷。
(二):RNA 的抽提
在经变性液匀浆的细胞或组织600ul+60ulpH4.0的2M乙酸钠混匀,可用漩涡振荡器。
600ul酚\*\*(25\24\1),混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
冰裕中10-15分钟,离心,4℃,10000g,20分钟。
上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇,-70℃,30分钟沉淀RNA。
离心4℃,10000g,20分钟。
沉淀RNA ,冷冻干燥15分钟 , RNA 沉淀重新溶于300ul变性液中,可振荡(有时为了帮助溶解,可在65℃加热,但时间应极短)。
60ulpH4.0的2M乙酸钠混匀,可用漩涡振荡器。
600ul酚\*\*(25\24\1),混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
冰裕中10-15分钟,离心,4℃,10000g,20分钟。
上层水相吸至无菌离心管中。
等体积异丙醇二次沉淀(-70℃,30分钟),75%乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥,复溶于去RNA 酶的水中(对于准备长期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M,再加入2.5体积的乙醇,-70℃保存。)
注:1变性液组成:25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mM β-巯基乙醇),65℃溶解,过滤灭菌,4℃预冷。
2酸性酚配制:55℃时,500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸钠,混匀,静止分层后,去上清,再反复加500ml50mM,pH4.0乙酸钠,直到pH<4.1。
方法二: 氯化锂法提取总RNA
本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA 酶,用氯化锂选择沉淀RNA ,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA ,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高,小RNA 片断丢失的缺陷。
仪器: 同上
试剂:
氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L,过滤灭菌】
悬浮液【10mM Tris-HCL (pH7.6) ,1mM EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】
其余同上
操作步骤:
1:对于大量组织或细胞,则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶液,匀桨器高速匀桨2分钟;对于少量细胞(107个细胞/ml),则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂-尿素溶液手工匀桨,并转移至Eppendof管中
2:匀桨液在0-4℃放置4小时后,12000g离心30分钟
3:取沉淀,加入原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液,重复步骤2
4:沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后,加入等体积酚/*/*在室温放置15-30分钟并不时摇动混匀,4000g离心5分钟
5:取上层水相,加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙醇,-20℃放置1小时,5000g离心。
6:70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
7:RNA 溶解液溶解沉淀,得RNA ,分装,于-70℃保存。