Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)是一种广泛应用于细胞生物学研究中的试剂,主要用于简便而准确地检测细胞增殖和活力。CCK-8基于WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)的还原反应,通过生成高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)来反映活细胞的数量和活力。本文将详细介绍CCK-8检测细胞增殖和活力的原理、方法及注意事项。
CCK-8试剂中的WST-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓(1-Methoxy PMS)的作用下,被细胞线粒体中的脱氢酶还原为水溶性的黄色甲瓒产物。这一还原反应与活细胞的数量和活力直接相关,生成的甲瓒物数量越多,表示活细胞数量越多,细胞活力越强。因此,通过测定甲瓒物的吸光度(OD值),可以间接反映细胞的增殖和活力情况。
仪器与试剂:准备台式离心机、细胞计数仪、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪(450nm滤光片)、CCK-8检测试剂盒、DMEM或其他培养基、双抗、FBS、PBS、DMSO等。
细胞悬液制备:将对数生长期的细胞进行消化、离心、计数,并制备成适当浓度的细胞悬液。
细胞接种:在96孔板中接种细胞悬液,每孔约100μL,细胞数量根据实验需求调整,一般贴壁细胞为3k-7k/孔,悬浮细胞可适当增加。将培养板放入培养箱中预培养24小时(37℃,5% CO2)。
药物处理(如适用):向培养板中加入不同浓度的待测药物或化合物,继续培养一定时间(如6、12、24或48小时)。
CCK-8检测:每孔加入10μL CCK-8溶液,注意避免产生气泡。将培养板放入培养箱中孵育1-4小时。
吸光度测定:使用酶标仪在450nm处测定各孔的吸光度(OD值)。
数据处理:根据OD值计算细胞存活率或抑制率,公式为:细胞存活率 = [(实验孔 - 空白孔) / (对照孔 - 空白孔)] × 100%;抑制率 = [(对照孔 - 实验孔) / (对照孔 - 空白孔)] × 100%。
细胞数量:细胞数量过低会影响检测结果的准确性,建议预先摸索合适的细胞接种数量。
气泡干扰:加样过程中避免产生气泡,气泡会干扰OD值的读数。
培养板边缘孔:培养板最外一圈的孔容易干燥挥发,建议只加培养基,不作为测定孔用。
药物影响:如果待测药物具有氧化还原性,可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基,以去除药物影响。
CCK-8保存:CCK-8试剂应保存在4℃或-20℃避光条件下,避免反复冻融。
波长选择:对于高浑浊度的细胞悬液,建议采用双波长测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。
CCK-8作为一种简便、快速、准确的细胞增殖和活力检测试剂,在细胞生物学研究中具有广泛应用。通过掌握其检测原理、方法及注意事项,可以确保实验结果的准确性和可靠性。未来,随着技术的不断发展,CCK-8将在更多领域发挥其重要作用。
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