Qiagen 51304 基因组DNA小提试剂盒科研应用指南

——高效、高纯度基因组DNA提取的标准化解决方案

一、产品原理与核心优势

1.1 技术原理

硅胶膜离心柱技术：

选择性结合DNA（>100 bp），高效去除蛋白质、RNA及小分子污染物

基于pH调控的吸附/洗脱机制（裂解液pH=8.0，洗脱液pH=8.5）

关键步骤：

细胞裂解（蛋白酶K+Buffer ATL）

核酸吸附（Buffer AL+乙醇）

杂质去除（Buffer AW1/AW2洗涤）

DNA洗脱（Buffer AE或水）

1.2 性能参数

指标 Qiagen 51304 传统酚-氯仿法

得率（哺乳动物细胞） 5-10 μg/10⁶ cells 3-8 μg/10⁶ cells

A260/A280 1.7-1.9 1.6-1.8（常含酚残留）

操作时间 20-30分钟 2-3小时

最大样本量 5×10⁶ cells或25 mg组织 需分多次处理

1.3 适用样本类型

推荐样本：

✓ 培养细胞（贴壁/悬浮）

✓ 动物组织（肝、脾等软组织优先）

✓ 血液（需配合红细胞裂解步骤）

不推荐样本：

✖ 植物组织（需专用试剂盒）

✖ 石蜡包埋样本（需脱蜡预处理）

二、标准化操作流程

2.1 实验前准备

试剂预冷：Buffer AW1/AW2需4℃保存，使用前室温平衡

样本预处理：

复制

贴壁细胞：胰酶消化后PBS重悬  

组织样本：液氮研磨至粉末状  

2.2 详细操作步骤

复制

1. 裂解：  

   - 加20 μL蛋白酶K + 200 μL Buffer ATL  

   - 56℃孵育10分钟（组织需延长至30分钟）  

2. 结合：  

   - 加200 μL Buffer AL + 200 μL乙醇（96-100%）  

   - 涡旋混匀15秒  

3. 过柱：  

   - 转移混合液至离心柱，≥6000 g离心1分钟  

4. 洗涤：  

   - 加500 μL Buffer AW1，离心1分钟  

   - 加500 μL Buffer AW2，离心3分钟（确保去盐）  

5. 洗脱：  

   - 加50-100 μL Buffer AE，室温静置5分钟后离心  

2.3 关键优化点

提高得率：

延长组织裂解时间至2小时

二次洗脱（使用同一洗脱液）

提高纯度：

增加AW2洗涤离心至5分钟

洗脱前空离2分钟去除残留乙醇

三、质量评估与问题排查

3.1 质检标准

纯度合格：A260/A280=1.7-1.9，A260/A230>2.0

完整性验证：

✓ 0.8%琼脂糖凝胶电泳，主带>10 kb（无拖尾）

✓ 适用于PCR、Southern blot等下游应用

3.2 常见问题诊断

现象 可能原因 解决方案

得率低 /乙醇比例错误 增加蛋白酶K用量/检查乙醇浓度

A260/A280异常 蛋白质或酚残留 增加AW2洗涤步骤

DNA降解 样本反复冻融/RNase污染 使用新鲜样本/添加RNase抑制剂

3.3 应用案例数据

案例1：小鼠尾尖基因分型

结果对比：

复制

Qiagen 51304：平均得率8.2 μg，PCR成功率98%  

CTAB法：平均得率5.1 μg，PCR成功率85%  

案例2：FFPE样本提取

优化方案：

增加蛋白酶K至40 μL，裂解过夜

得率提升3倍（从0.5 μg至1.5 μg/10 μm切片）

四、技术问答（Q&A）

Q1：能否用于微量样本（<10⁴ cells）？

需配合 载体RNA（如Qiagen 1017456） 提高回收率（建议终浓度5 ng/μL）

Q2：洗脱缓冲液选择建议？

Buffer AE：含EDTA，适合长期储存（-20℃）

无菌水：适用于立即使用的PCR等应用

文档优化建议：

插入 【电泳检测示例图】 标注完整性与降解DNA区别

添加 得率计算工具 二维码（链接至在线计算器）

关键步骤用 ⚠️注意 标注（如"勿让离心柱干燥"）