不同类型的电泳实验在凝胶制备和气泡处理上有哪些特殊要求？

SDS - PAGE 电泳

• 凝胶制备特殊要求

• 凝胶浓度选择：根据目标蛋白质的分子量大小选择合适的凝胶浓度。一般来说，分离小分子蛋白质（<20 20="" 60="" -="">60 kDa）则使用 7% - 8% 的凝胶。

• 严格控制试剂比例：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例、缓冲液的 pH 值以及引发剂和加速剂的用量等都要精确控制，以保证凝胶的聚合效果和孔径大小均匀性。例如，通常使用的分离胶缓冲液 pH 为 8.8，浓缩胶缓冲液 pH 为 6.8，过硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMED）的用量要根据具体实验条件进行优化，一般过硫酸铵的浓度在 0.1% - 0.5%，TEMED 的浓度在 0.05% - 0.1%。

• 气泡处理特殊要求：由于 SDS - PAGE 电泳对条带的分辨率要求较高，凝胶中的气泡会严重影响蛋白质的迁移和分离效果，因此在气泡处理上要更加严格。在凝胶灌注过程中，可采用长针头注射器将凝胶溶液缓慢注入电泳槽中，尽量避免溶液与空气接触产生气泡。如果发现凝胶中有气泡，应及时用细针挑破或采用振动法使气泡排出，确保凝胶中无气泡存在，以获得清晰、整齐的蛋白质条带。

琼脂糖凝胶电泳

• 凝胶制备特殊要求

• 琼脂糖纯度和浓度：根据分离的核酸片段大小选择合适的琼脂糖浓度。一般来说，分离小于 0.5 kb 的 DNA 片段，可使用 2.0% - 3.0% 的琼脂糖凝胶；分离 0.5 - 2 kb 的 DNA 片段，常用 1.0% - 1.5% 的凝胶；而对于大于 2 kb 的 DNA 片段，则使用 0.7% - 1.0% 的琼脂糖凝胶。同时，要选择高纯度的琼脂糖，以减少杂质对核酸迁移的影响。

• 加热溶解均匀：在制备琼脂糖凝胶时，需要将琼脂糖粉末加入到缓冲液中加热溶解。加热过程中要不断搅拌，确保琼脂糖溶解，避免出现局部浓度过高或过低的情况。溶解后的琼脂糖溶液要冷却至适当温度（一般为 50 - 60℃）后再倒入模具中，防止温度过高导致凝胶收缩或产生气泡。

• 气泡处理特殊要求：琼脂糖凝胶电泳中气泡的存在可能会导致核酸条带变形或出现断裂现象。在倒入琼脂糖溶液时，动作要平稳，避免产生气泡。如果有气泡产生，可以用吸管将其吸出，或者待凝胶凝固后，用刀片将含有气泡的部分切除。对于一些低熔点琼脂糖凝胶，由于其凝固点较低，在处理气泡时要注意保持环境温度稳定，避免凝胶在处理过程中融化。

等电聚焦电泳

• 凝胶制备特殊要求

• 两性电解质选择：等电聚焦电泳需要使用两性电解质来形成 pH 梯度。不同的样品需要选择合适的两性电解质混合物，其 pH 范围要涵盖目标蛋白质的等电点。例如，对于等电点在 4 - 6 之间的蛋白质，可选择 pH 3 - 10 的两性电解质，并适当调整其比例，以获得更精确的 pH 梯度。

• 凝胶聚合条件精确控制：凝胶的聚合过程要严格控制温度、时间和引发剂的用量，以确保凝胶中 pH 梯度的稳定性和准确性。一般在低温（4 - 10℃）下进行聚合，聚合时间相对较长，可能需要数小时甚至过夜。引发剂的用量要根据具体的凝胶配方和实验条件进行优化，以保证凝胶聚合均匀，pH 梯度稳定。

• 气泡处理特殊要求：等电聚焦电泳中气泡的存在会干扰 pH 梯度的形成，影响蛋白质的聚焦效果。在凝胶制备过程中，要尽量避免气泡的产生。如果出现气泡，应采用温和的方法去除，如使用细针小心地将气泡挑出，或者在凝胶表面覆盖一层液体石蜡，防止空气进入凝胶产生气泡。同时，在电泳过程中，也要注意观察凝胶中是否有新的气泡产生，如有需要及时处理。