细胞计数板的使用方法和注意事项

一、使用前准备

1. 器材与试剂

• 计数板：常见类型包括改良 Neubauer 计数板（规格：1×1×0.1 mm³，分 9 个大方格）、一次性塑料计数板（如 CHET4-SD100-002）。

• 工具：显微镜（配备 10× 物镜）、微量移液器（10~100 μL）、盖玻片（专用或 22×22 mm 标准玻片）、细胞悬液、台盼蓝染色液（如需区分死活细胞）。

2. 计数板预处理

• 清洁：用无水乙醇或 75% 酒精擦拭计数板表面，再用无尘纸擦干，避免油脂或杂质影响液体铺展。

• 安装盖玻片：将盖玻片平稳覆盖在计数板的计数区上方，确保无气泡且边缘紧密贴合（通过毛细作用固定）。

二、操作步骤

1. 细胞悬液制备

• 混匀样本：用吸管或移液器反复吹打细胞悬液 3~5 次，确保细胞均匀分散（避免沉淀导致取样偏差）。

• 稀释（如需）：若细胞浓度过高（如 >1×10⁶ cells/mL），需用培养基或 PBS 按比例稀释（如 1:10），使计数时每个中方格细胞数控制在 5~50 个（便于统计）。

2. 加样

• 用微量移液器吸取 10~20 μL 细胞悬液，沿盖玻片边缘缓慢滴加（避免直接滴在计数区中央）。

• 液体通过毛细作用自动铺展并覆盖计数区，确保无气泡、无液滴溢出边缘（若有气泡需重新清洁计数板并加样）。

3. 静置沉降

• 加样后将计数板水平放置于显微镜载物台上，静置 1~2 分钟，使细胞沉降到计数板底部（避免悬浮细胞导致计数误差）。

4. 显微镜观察与计数

• 低倍镜定位：先用 10× 物镜找到计数板的中央大方格（含 25 个中方格或 16 个中方格，根据计数板类型而定）。

• 高倍镜计数：切换至 20× 或 40× 物镜，按对角线原则选择 4 个角的中方格 + 中央中方格（共 5 个中方格）进行计数。

• 压线细胞处理：遵循 “计上不计下，计左不计右" 原则，避免重复计数。

• 死活细胞区分：若加入台盼蓝，活细胞透明，死细胞染成蓝色，需分别计数并计算存活率（存活率 = 活细胞数 / 总细胞数 × 100%）。

5. 计算细胞浓度

• 公式推导：

• 若计数 5 个中方格的细胞总数为 $N$，稀释倍数为 $D$，则：$\text{细胞浓度（cells/mL）}=\frac{N}{5}\times 25\times 10^4\times D=N\times 5\times 10^4\times D$
  （原理：5 个中方格体积为 $5\times 0.1{\text{mm}}^3=0.5\mu \text{L}=5\times 10^{-4}\text{mL}$，需换算为 1 mL 的浓度）。

三、注意事项

1. 操作规范性

• 避免细胞损伤：吹打悬液时力度适中，避免剧烈震荡导致细胞破裂（尤其对贴壁细胞或脆弱细胞）。

• 加样量精准：移液器需定期校准，加样时保持垂直角度，避免液体残留于枪头或管壁。

• 温度控制：细胞悬液和计数板需保持室温（20~25℃），避免温度差异导致细胞活性变化或液体挥发。

2. 计数准确性优化

• 重复计数：同一悬液制备 2~3 个计数板样本，取平均值（若单次结果偏差 >10%，需重新实验）。

• 适宜浓度范围：理想计数浓度为 1×10⁴~1×10⁶ cells/mL，浓度过低时建议离心富集（如 500×g 离心 5 分钟，弃上清后重悬）。

3. 污染与损耗控制

• 一次性计数板：开封后立即使用，避免长时间暴露于空气中导致灰尘污染。

• 玻璃计数板：使用后及时用清水冲洗（勿用硬物刮擦），晾干后存放于干燥盒中，避免霉菌滋生。

• 生物安全：处理感染性样本（如病毒转染细胞）时，需在生物安全柜中操作，计数板用后需高压灭菌再丢弃。

4. 结果记录与分析

• 记录计数日期、样本信息、稀释倍数、各中方格细胞数及死活细胞比例，便于溯源和误差分析。

• 若结果异常（如与历史数据偏差 >20%），需排查悬液混匀度、加样气泡、计数板清洁度等因素，必要时更换新计数板。

四、常见问题与解决方案

五、适用场景与替代方案

• 常规细胞计数：适用于悬浮细胞（如 PBMC、酵母）和消化后的贴壁细胞（如 HEK293、HeLa）。

• 高精度需求场景：若需自动化计数或减少人为误差，可选用荧光细胞计数板（配合荧光显微镜）或自动细胞计数仪（如 TC20、Countess III）。