提高 SDS-PAGE 凝胶电泳分辨率的其他操作流程

合理选择凝胶浓度：依据目标蛋白质分子量精准匹配凝胶浓度是关键。当分析小于 20kDa 的小分子蛋白质时，12% - 15% 的高浓度凝胶能提供更细密的分子筛效应，限制小分子蛋白质的迁移，实现精细分离；而对于大于 100kDa 的大分子蛋白质，7% - 10% 的低浓度凝胶更合适，较大的孔径可确保大分子顺利通过凝胶。若样品蛋白质分子量范围跨度大，梯度凝胶（如 4% - 20%）能实现从低浓度到高浓度的过渡，使不同大小蛋白质在凝胶的不同区域得到最佳分离 。

严格把控凝胶聚合：聚合过程中，温度、催化剂用量都会影响凝胶质量。将聚合温度严格控制在 20 - 25℃，能保证凝胶孔径均匀；精确添加过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED），APS 作为引发剂，TEMED 加速聚合反应，二者比例失调会导致凝胶聚合异常。同时，新鲜配制 APS 溶液，且 1 周内使用，可保证其活性，避免因引发剂失效造成聚合、孔径不均的问题。

精准控制上样量：上样量过多会使蛋白质在凝胶中过度堆积，导致条带拖尾、重叠，严重影响分辨率。一般每孔总蛋白上样量控制在 10 - 20μg，纯化蛋白质样品 5 - 10μg 即可。使用校准后的微量移液器，缓慢且精准地吸取和添加样品，防止样品溢出污染相邻泳道，同时保证各泳道上样量一致，避免因上样差异干扰分辨率。

优化样品变性处理：样品与上样缓冲液混合后，煮沸时间需精准控制。通常 5 - 10 分钟为宜，时间过短蛋白质无法充分变性，影响其在凝胶中的迁移；时间过长，部分蛋白质可能发生聚集，形成大分子复合物，改变迁移特性。对于含大量二硫键的蛋白质，可适当延长煮沸时间至 10 分钟，确保二硫键充分断裂，使蛋白质伸展为线性分子。

优化电泳缓冲液：Tris - 甘氨酸缓冲液是常用选择，但要确保其 pH 稳定在 8.3 左右，pH 波动会改变蛋白质所带电荷，影响迁移速度和分离效果。定期更换电泳缓冲液，随着电泳进行，缓冲液中离子不断消耗，离子强度改变会影响电场稳定性和蛋白质迁移，一般连续使用 2 - 3 次后更换新缓冲液。对于对分辨率要求高的小分子蛋白质分离，可尝试 MOPS 或 MES 缓冲系统，它们能提供更稳定的 pH 环境和更好的分离效果。

调整电泳电压与时间：降低电泳电压并适当延长电泳时间，可使蛋白质在凝胶中迁移更充分，减少扩散，获得更清晰条带。例如，将电压从 200V 降至 100V，虽然电泳时间延长，但蛋白质有更充足时间依据分子量差异进行分离，分辨率显著提高。同时，采用分步电压策略，开始用较低电压（如 80V）使蛋白质在凝胶中均匀分布，再逐步升高电压（如 120V）加快分离进程，也是提升分辨率的有效方法。

运用梯度凝胶电泳：梯度凝胶的孔径沿凝胶长度方向逐渐变化，蛋白质在迁移过程中，随着孔径变小，不同分子量蛋白质在合适孔径处停止迁移，实现更精细分离。相较于均一浓度凝胶，梯度凝胶能在同一凝胶上分离更宽分子量范围的蛋白质，且条带更锐利、分辨率更高，尤其适合复杂蛋白质混合物分析。

选择高质量预制胶与设备：高质量预制胶经过严格质量控制，凝胶浓度均一、聚合条件稳定，能减少因手工制胶误差导致的分辨率降低问题。同时，确保电泳槽干净无污染，残留的 SDS、蛋白质会干扰电场分布和蛋白质迁移；使用精准控温、稳定电场的电泳仪，为蛋白质分离提供稳定环境，也是提高分辨率的重要保障。