SDS-PAGE 一步法凝胶快速制备试剂盒操作流程详解

一、实验前准备与试剂预混

1. 试剂解冻与平衡

   从 - 20℃冰箱取出试剂盒中的预制胶母液（含分离胶与浓缩胶预混液）、催化剂（如过硫酸铵溶液、TEMED）及电极缓冲液，室温放置 10-15 分钟至解冻。

• 确保所有试剂无沉淀或分层，若出现轻微浑浊，可轻轻颠倒混匀，避免剧烈振荡产生气泡。

2. 器材预处理

• 组装垂直电泳槽（如 Mini-PROTEAN® 系统），用 75% 乙醇擦拭玻璃板内侧，去除油污与杂质，晾干后安装密封夹，确保玻璃板边缘无渗漏。

二、凝胶制备与灌注

1. 一步法胶液配制

• 根据实验需求（如分离胶浓度：常用 8%-15%），按试剂盒说明书比例取预制胶母液。例如，制备 10% 分离胶时，取 5 mL 母液加入 0.1 mL 催化剂 A（过硫酸铵）和 5 μL 催化剂 B（TEMED），立即用移液器吹打 3-5 次混匀（动作需迅速，避免胶液提前凝固）。

2. 垂直灌注分离胶

• 用 10 mL 注射器吸取混合胶液，从玻璃板间隙底部缓慢注入，至距离梳子底部约 1.5 cm 处停止（预留浓缩胶空间）。

• 立即在胶液表面覆盖一层约 500 μL 的正丁醇或水饱和异丁醇，液面需平整，以隔绝空气并促进胶面凝固（约 15-20 分钟）。

3. 制备浓缩胶

• 倒去覆盖液，用滤纸吸干胶面残余液体，取浓缩胶预混液（通常 4% 浓度）2 mL，加入 0.05 mL 催化剂 A 和 2 μL 催化剂 B，混匀后注入分离胶上方，至玻璃板顶端。

• 插入配套梳子，避免气泡残留，室温静置 10-15 分钟至凝固。

三、样品处理与上样

1. 蛋白样品制备

• 取细胞、组织或纯化蛋白样品，按 1:1 比例加入试剂盒提供的 2×SDS 上样缓冲液（含 β- 巯基乙醇、溴酚蓝），100℃沸水浴煮 5 分钟，使蛋白充分变性并解离为亚基。

• 12000 rpm 离心 5 分钟，取上清备用（避免沉淀堵塞加样孔）。

2. 上样操作

• 小心拔出梳子，用 1× 电极缓冲液冲洗加样孔，去除未凝固的胶块与杂质。

• 用微量进样器按顺序加入样品（每孔 10-20 μL），同时加入预染蛋白 Marker（如 10-170 kDa）作为分子量参照，注意避免交叉污染。

四、电泳与凝胶检测

1. 电泳参数设置

• 向电泳槽上下槽加入 1× 电极缓冲液（确保上槽液覆盖加样孔），连接电源，初始电压设置为 80 V，待溴酚蓝前沿进入分离胶后，调至 120 V 恒压电泳（约 40-60 分钟，具体时间取决于胶浓度与蛋白大小）。

2. 终止电泳与凝胶回收

• 当溴酚蓝前沿接近胶底部时，关闭电源，拆卸电泳槽，用刀片小心撬开玻璃板，凝胶应牢固附着于其中一块板上。

• 若需染色，可直接进行考马斯亮蓝染色（试剂盒或自备染色液），或转膜用于 Western blot（按常规流程操作）。

五、注意事项与关键控制点

• 催化剂用量精确性：过硫酸铵与 TEMED 的添加量需严格按说明书执行，过量会导致凝胶脆性增加，不足则凝固。

• 温度控制：凝胶凝固速度受温度影响（25℃时最佳），低温环境可适当延长静置时间，避免频繁移动电泳槽。

• 气泡排除：灌注胶液时需保持注射器垂直，速度均匀，若出现气泡，可用针头小心挑破或重新灌注。

• 样品兼容性：高盐或高浓度去污剂样品需预先透析或稀释，避免影响电泳分辨率。

六、流程对比与效率优势