Western及IP裂解液的使用方法及注意事项

一、Western 及 IP 裂解液的使用方法

1. 实验前准备

• 样本收集：根据实验需求收集细胞或组织样本。对于细胞样本，贴壁细胞需先用 PBS 缓冲液轻柔洗涤 2 - 3 次，去除培养基残留；悬浮细胞则通过离心（通常 500 - 1000 rpm，3 - 5 分钟）收集，并用 PBS 重悬洗涤。组织样本需在预冷的生理盐水中清洗，去除血液等杂质，并用干净的剪刀或刀片将其剪碎成小块。

• 裂解液准备：从低温储存环境（-20℃或 4℃，根据产品说明）取出裂解液，平衡至室温。若裂解液中蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等为单独包装，需在使用前按照说明准确添加到裂解液中，并充分混匀。

2. 样本裂解

• 细胞样本裂解：对于贴壁细胞，可直接在培养板中加入适量裂解液（通常每 1×10⁶个细胞加入 100 - 200 μL 裂解液），轻轻摇晃培养板使裂解液均匀覆盖细胞表面，然后置于冰上，通过温和振荡（如涡旋振荡器，低速振荡 1 - 2 分钟）或超声处理（30 秒超声，间隔 30 秒，重复 3 - 5 次，超声功率需根据细胞类型调整）进行裂解。悬浮细胞则需先离心去除 PBS，再加入裂解液，同样在冰上进行振荡或超声处理。

• 组织样本裂解：将剪碎的组织样本转移至预冷的匀浆器或离心管中，按照每 100 mg 组织加入 500 - 1000 μL 裂解液的比例添加裂解液。先使用机械匀浆器进行初步匀浆，使组织破碎，然后结合超声处理进一步裂解细胞，确保蛋白质充分释放。

3. 蛋白质提取

• 静置与离心：样本裂解完成后，将其置于冰上静置 5 - 10 分钟，使裂解更充分。随后，将裂解物转移至离心管中，在 4℃条件下，以 12000 - 15000 rpm 离心 10 - 15 分钟，使细胞碎片、不溶性物质沉淀于管底，而上清液即为含有蛋白质的裂解产物。

• 收集上清：小心吸取上清液至新的离心管中，避免吸入沉淀。若后续实验对蛋白质浓度要求较高，可对上清液进行适当浓缩处理，如使用超滤管进行浓缩。

二、使用 Western 及 IP 裂解液的注意事项

1. 裂解液储存与保质期

• 储存条件：裂解液应严格按照产品说明进行储存，多数需在 - 20℃低温保存，避免反复冻融，因为多次冻融可能导致蛋白酶抑制剂等成分失活，影响裂解效果。若裂解液含有对温度敏感的特殊成分，可能需要在 4℃保存。

• 保质期检查：使用前需检查裂解液的保质期，过期的裂解液可能因成分降解而无法有效裂解细胞或保护蛋白质，从而影响实验结果。若裂解液出现浑浊、沉淀或颜色异常等情况，应避免使用。

2. 操作过程中的细节把控

• 低温操作：整个样本裂解和处理过程应尽量在冰上或 4℃环境中进行，以降低细胞内蛋白酶的活性，减少蛋白质的降解。特别是对于一些不稳定或易降解的蛋白质，低温操作尤为重要。

• 避免交叉污染：使用无菌的移液器枪头、离心管等实验器具，避免不同样本之间的交叉污染。同时，在添加裂解液、吸取上清等操作时，要小心谨慎，防止液体溅出污染其他样本或实验环境。

• 裂解条件优化：不同的细胞类型和组织样本对裂解条件的要求可能不同，需根据实际情况优化裂解时间、超声功率、振荡强度等参数。例如，对于一些细胞壁较厚的植物细胞或坚韧的组织样本，可能需要适当延长裂解时间或提高超声功率，但也要避免过度裂解导致蛋白质结构破坏。

3. 与后续实验的兼容性

• 成分兼容性：确保裂解液中的成分不会对后续实验产生干扰。例如，若后续要进行蛋白质纯化（如亲和层析、离子交换层析），裂解液中的高浓度盐、去垢剂等成分可能影响纯化效果，需进行适当的透析、稀释或更换缓冲液等处理。若进行质谱分析，需注意裂解液中的某些添加剂可能会影响质谱检测，应选择质谱兼容的裂解液或进行样品预处理。

• 实验体系匹配：根据后续实验目的选择合适的裂解液。若进行 Western Blot 实验，需保证裂解液能够使蛋白质充分变性；若进行 IP 实验，则要选择能够保持蛋白质天然构象的温和型裂解液，以确保蛋白质 - 蛋白质相互作用不被破坏。