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样品制备环节：蛋白质未提取或降解（未加蛋白酶抑制剂）、样品上样量不足（低于检测下限，如目标蛋白含量＜1 pg）；
电泳环节：凝胶浓度不匹配（如检测 20 kDa 小蛋白用 10% 凝胶，蛋白跑出色谱胶）、电泳时间过长（蛋白迁移至凝胶外）；
转膜环节：转膜方向反了（蛋白未转移到膜上，仍留在凝胶中）、转膜效率低（如 PVDF 膜未用甲醇激活，无法吸附蛋白）；
免疫反应环节：一抗与目标蛋白不匹配（如用兔抗小鼠蛋白抗体检测人源样本）、一抗浓度过低（如 1:10000 稀释导致结合不足）、抗体失效（反复冻融或过期）；
信号检测环节：ECL 底物过期（发光效率下降）、成像时间过短（未捕获到弱信号）。
样品制备排查：
用 BCA 法（如罗氏 BCA Protein Assay Kit）检测蛋白质浓度，确保上样量≥20 μg（或目标蛋白含量≥1 pg）；
提取时添加新鲜的蛋白酶抑制剂（如罗氏 Complete™ Protease Inhibitor Cocktail，含 6 种抑制剂，可抑制丝氨酸 / 半胱氨酸蛋白酶等），避免蛋白质降解；
电泳与转膜验证：
根据目标蛋白分子量选择凝胶浓度（参考：10-50 kDa 用 15% 凝胶，50-100 kDa 用 10% 凝胶，100-200 kDa 用 8% 凝胶），电泳后用考马斯亮蓝染色凝胶，确认蛋白已进入凝胶且未跑穿；
转膜前用甲醇浸泡 PVDF 膜 10 秒（激活羟基），转膜后用丽春红 S 染色膜，观察是否有蛋白质条带（若有则证明转膜成功，无则检查转膜方向或缓冲液）；
免疫反应优化：
核对一抗说明书，确认种属匹配（如检测人 EGFR 需用抗人 EGFR 抗体，而非抗小鼠 EGFR），优先选择经过验证的单克隆抗体（如罗氏 Anti-EGFR Monoclonal Antibody，经 WB 验证，特异性＞99%）；
调整一抗浓度（推荐起始浓度 1:1000-1:5000），4℃孵育过夜（延长结合时间），洗膜时用 TBST 缓冲液（含 0.1% Tween-20）充分洗涤（3 次 ×15 分钟），避免未结合抗体残留；
信号检测保障：
使用新鲜的 ECL 底物（如罗氏 Lumi-Light™ Plus Substrate，发光时间长达 8 小时），先进行 5 分钟预曝光，若信号弱则延长至 10-30 分钟，或使用高灵敏度成像仪（如罗氏 ChemiDoc™ MP Imaging System，检测下限达 0.1 pg）。
样品制备：蛋白质未充分变性（如 SDS 上样缓冲液未加 β- 巯基乙醇，或加热时间不足）、样品中含大量杂质（如盐浓度过高，导致电泳时蛋白迁移不均）；
电泳环节：凝胶聚合不均（APS 或 TEMED 添加量不足，导致凝胶孔径不一致）、电泳缓冲液反复使用（离子浓度下降，导电性减弱）；
转膜环节：转膜电流过大（膜发热导致蛋白扩散）、凝胶与膜之间有气泡（局部转膜不，条带断裂）。
样品处理优化：
确保上样缓冲液中 β- 巯基乙醇终浓度为 5%，95℃加热 10 分钟（而非 5 分钟），使蛋白质变性（线性化）；
若样品盐浓度高（如从高盐缓冲液中提取），用透析袋（截留分子量 3 kDa）透析 24 小时（换液 3 次），或使用脱盐柱（如罗氏 HiTrap™ Desalting Columns）去除盐分；
电泳条件控制：
使用新鲜配制的电泳缓冲液（Tris - 甘氨酸 - SDS 缓冲液，pH 8.3），避免反复使用（建议使用次数≤3 次）；
选择预制胶（如罗氏 ExcelGel™ SDS 预制胶，工厂标准化生产，孔径均匀性 CV 值＜5%），避免手动制胶导致的聚合不均；
转膜操作规范：
采用恒压转膜（而非恒流），根据膜面积调整电压（如 7 cm×8 cm 膜用 25 V 转膜 30 分钟），转膜时在冰浴中进行（避免膜发热）；
铺膜时用玻璃棒轻轻滚动，排除凝胶与膜之间的气泡（可在膜上滴加少量转膜缓冲液，帮助气泡排出）。
蛋白质修饰影响：目标蛋白存在翻译后修饰（如磷酸化、糖基化、泛素化），导致分子量增大（如未磷酸化的 ERK 分子量约 42 kDa，磷酸化后因电荷变化，迁移速度减慢，条带偏移至 45 kDa 左右）；
电泳参数偏差：凝胶浓度错误（如检测 40 kDa 蛋白用 15% 凝胶，而非 10%，导致蛋白迁移过快，条带分子量偏小）、电泳电压过高（迁移速度加快，条带位置偏上）；
样品降解：蛋白质部分降解（如提取后未及时检测，导致 C 端或 N 端片段断裂），出现 “小分子量杂带"，误判为目标条带。
修饰验证：
若怀疑磷酸化修饰，可同时检测磷酸化与非磷酸化形式（如用罗氏 Anti-p-ERK 与 Anti-ERK 抗体，前者条带偏移，后者为标准分子量）；
若为糖基化修饰，用糖苷酶（如 PNGase F）处理样品（37℃孵育 1 小时），去除糖链后再电泳，观察条带是否恢复至预期分子量；
电泳参数校准：
严格按照目标蛋白分子量选择凝胶浓度（参考表 1），并使用蛋白分子量标准品（如罗氏 Precision Plus Protein™ Standards，含 10 种蛋白，分子量 10-250 kDa），每次实验均上样标准品，校准条带位置；
控制电泳电压（浓缩胶 80 V，分离胶 120 V），避免电压过高（如 150 V）导致迁移速度异常；
降解防控：
蛋白质提取后立即进行电泳（或 - 80℃分装保存，避免反复冻融），若需长期保存，添加蛋白酶抑制剂（如罗氏 Complete™ Mini EDTA-free，适合金属蛋白酶抑制）。
封闭不充分：封闭液选择错误（如检测磷酸化蛋白用脱脂牛奶，牛奶中内源性磷酸酶与抗体交叉反应）、封闭时间过短（如室温孵育 30 分钟，覆盖非特异性位点）；
抗体非特异性结合：一抗浓度过高（如 1:500 稀释，导致非特异性结合增多）、二抗与膜或封闭液成分交叉反应（如用羊抗兔二抗检测兔源封闭蛋白）；
试剂污染：ECL 底物污染（如混入杂质，导致非特异性发光）、膜被荧光物质污染（如戴手套接触膜，手套上的荧光剂残留）。
封闭条件优化：
根据检测目标选择封闭液（参考表 2），如检测磷酸化蛋白或生物素标记抗体，优先用 3% BSA（如罗氏 Albumin from Bovine Serum，无内源性磷酸酶与生物素），避免用脱脂牛奶；
延长封闭时间（室温 2 小时或 4℃过夜），封闭过程中持续摇床振荡（50 rpm），确保封闭液均匀覆盖膜表面；
抗体浓度调整：
降低一抗浓度（如从 1:500 调整为 1:2000），并进行梯度稀释实验（1:1000、1:2000、1:5000），选择 “条带清晰且背景低" 的最佳浓度；
选择交叉反应率低的二抗（如罗氏 HRP-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG，经亲和纯化，与小鼠 IgG 交叉反应率＜0.5%），二抗浓度控制在 1:5000-1:10000；
污染防控：
使用新鲜开封的 ECL 底物，避免反复使用（单次使用后丢弃剩余底物）；
操作时戴无粉手套，避免用手直接接触膜（可使用镊子夹取膜边缘），膜的存放环境避免荧光灯直射（防止荧光物质激发）。
抗体特异性差：一抗为多克隆抗体（识别多个表位，与同源蛋白交叉反应）、一抗与样品中其他蛋白有同源序列（如检测 EGFR 时，与 ERBB2 蛋白交叉反应）；
蛋白降解或聚合：样品中目标蛋白部分降解（产生小分子量片段，形成杂带）、蛋白质聚合（如加热不充分，形成二聚体 / 三聚体，出现大分子量杂带）；
转膜污染：转膜时凝胶中的蛋白转移到膜的非预期区域（如相邻泳道的蛋白扩散，形成横向杂带）。
抗体选择优化：
优先使用单克隆抗体（如罗氏 Anti-KRAS Monoclonal Antibody，仅识别 KRAS 蛋白的特定表位，交叉反应率＜0.1%），避免使用多克隆抗体；
查阅抗体说明书，确认是否有 WB 验证数据（如是否标注 “仅在 42 kDa 处出现单一条带"），选择经过同行评审的抗体；
样品处理改进：
提取后立即添加蛋白酶抑制剂（如罗氏 Complete™ Protease Inhibitor Cocktail），并在 - 80℃分装（避免反复冻融导致降解）；
确保上样缓冲液中 SDS 浓度为 2%，95℃加热 10 分钟，使蛋白质解聚（避免二聚体形成）；
转膜与电泳控制：
上样时避免样品溢出（每个泳道上样量不超过泳道体积的 80%），电泳时使用新鲜缓冲液，避免蛋白扩散；
转膜后用丽春红 S 染色，确认相邻泳道无蛋白交叉污染，若有则增加泳道间距或降低上样量。
目标蛋白丰度低：样品中目标蛋白含量低于检测下限（如＜0.1 pg）、样品上样量不足（如仅上样 5 μg 蛋白）；
抗体亲和力低：一抗与目标蛋白的亲和力常数（KD）过大（如＞10⁻⁹ mol/L，结合能力弱）、二抗偶联效率低（如酶与抗体的偶联比例 DOL＜1，信号放大不足）；
检测系统灵敏度低：ECL 底物发光效率低（如普通底物，而非增强型）、成像仪检测限高（如无法捕获皮克级信号）。
样品富集与上样优化：
若目标蛋白丰度低（如血清中的细胞因子），使用免疫沉淀（IP）富集（如罗氏 Protein G Sepharose™ 4 Fast Flow，特异性结合抗体 - 抗原复合物），富集后再进行 WB 实验；
增加上样量（如从 10 μg 增至 30 μg），但需注意避免过载（导致条带饱和，影响定量）；
抗体与底物选择：
选择高亲和力一抗（如罗氏 Anti-p53 Antibody，KD=10⁻¹² mol/L，结合能力是普通抗体的 1000 倍），二抗选择高偶联效率的产品（如罗氏 HRP-Conjugated 二抗，DOL=2-3）；
使用增强型 ECL 底物（如罗氏 Lumi-Light™ Plus Substrate，发光强度是普通底物的 5 倍），延长曝光时间（如从 1 分钟增至 10 分钟）；
检测仪器升级：
使用高灵敏度成像仪（如罗氏 ChemiDoc™ MP Imaging System，配备高分辨率 CCD 相机，检测下限达 0.1 pg），避免使用 X 光片（曝光时间固定，难以捕捉弱信号）。
操作不标准化：上样量不一致（如手动加样时，每孔体积偏差＞1 μL）、孵育时间 / 温度波动（如一次 4℃过夜，一次室温 2 小时）；
试剂批次差异：不同批次的一抗亲和力不同（如多克隆抗体制备过程中，批次间特异性差异）、ECL 底物发光效率波动（如不同批次的底物活性差异）；
仪器未校准：成像仪的灰度值检测未校准（如每次实验的曝光参数不同，导致灰度值无法比较）、分析软件参数设置不一致（如阈值选择不同）。
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