亲水作用色谱柱及其专用流动相在极性代谢物分析中的机理与应用

亲水作用色谱柱及其专用流动相在极性代谢物分析中的机理与应用

内容简介：
本文系统论述了亲水作用色谱（HILIC）作为一种强极性化合物保留与分离的有效策略，其保留机理、固定相分类以及方法开发要点。文章重点剖析了HILIC模式下水在固定相表面形成富水层的作用，并详细探讨了流动相中有机溶剂比例、缓冲盐种类、浓度和pH值如何精密调控分析物的保留与选择性。针对极性代谢组学这一热门应用领域，本文提供了从样品制备（需使用高乙腈含量的溶剂沉淀蛋白）、色谱柱选择（酰胺基、二醇基、 zwitterionic 固定相）到质谱兼容流动相优化的完整解决方案，旨在解决强极性小分子在反相色谱上不保留或保留过弱的难题。

关键词： 亲水作用色谱（HILIC）、极性代谢物、保留机理、流动相优化、质谱兼容性

正文：

在代谢组学、 pharmaceuticals 杂质分析和食品安全检测中，强极性和亲水性小分子（如氨基酸、核苷、糖类、有机酸、水溶性维生素）的分析始终是一个挑战。由于它们在反相色谱（RPLC）固定相上保留极弱，通常在死时间附近被洗脱，无法与基质中的其他成分有效分离。亲水作用色谱（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC）的出现，为这一难题提供了解决方案。

一、 HILIC的保留机理：不止于分配

HILIC的保留机理比RPLC更为复杂，通常认为是多种作用力的综合结果：

1. 分配作用：这是最核心的机理。HILIC固定相表面通常富含极性官能团（如酰胺、二醇、羧基等），流动相中的高比例水（通常>3%）会吸附在固定相表面，形成一个富水的液层。分析物在流动相（高比例有机相，如乙腈）和这个静态水层之间进行分配。极性越强的化合物，其亲水性越强，越容易分配进入水层，因此保留时间越长。

2. 氢键作用：分析物与固定相表面的极性官能团形成氢键。

3. 偶极-偶极相互作用：分析物与固定相之间的极性相互作用。

4. 离子交换作用：对于某些固定相（如硅胶羟基、未封端的残留硅羟基或zwitterionic固定相），如果分析物是离子化的，可能会发生离子交换作用。这部分作用可以通过调节缓冲盐浓度和pH来调控。

二、 HILIC固定相的分类与选择

HILIC固定相的多样性是其强大功能的体现，主要分为：

• 中性固定相：如酰胺基（-CONH₂）、二醇基（-CH(OH)-CH₂OH）。它们主要通过分配和氢键作用保留分析物，离子交换作用较弱，适用于中性极性分子和弱离子化合物，峰形较好。

• 带电固定相：

• 酸性固定相：如未封端的硅胶（表面有酸性硅羟基）。在中性pH下带负电，可通过阳离子交换作用保留带正电的化合物。

• 碱性固定相：如氨基（-NH₂）柱。氨基在酸性条件下质子化带正电，可通过阴离子交换作用保留带负电的化合物。但氨基柱不稳定，易发生氧化或与醛酮反应。

• 两性离子固定相（ZIC-HILIC）：同时含有磺酸基（带负电）和季铵基（带正电）。在很宽的pH范围内整体呈电中性，主要通过强烈的分配作用保留化合物，离子交换作用最小化，能获得非常对称的峰形，尤其适合酸碱两性化合物（如氨基酸、神经递质）。

三、 流动相优化：精密的平衡艺术

HILIC方法开发的核心是流动相的优化。

1. 有机相比例：通常起始有机相（乙腈）比例在80%-95%之间。增加有机相比例会增强保留（这与RPLC相反），因为促进了分析物向水层的分配。乙腈因其弱极性、高UV透过性和低粘度，是有机溶剂。

2. 缓冲盐与pH值：缓冲盐至关重要，其作用包括：(a) 控制分析物的电离状态；(b) 抑制固定相和分析物上的带电基团之间的次级离子交换作用。常用浓度为5-20 mM。甲酸铵/乙酸铵是质谱检测，因其具有挥发性。pH值通过影响分析物和固定相的电离，对选择性和保留时间有显著影响。例如，在ZIC-HILIC柱上，降低pH会使酸性化合物质子化（中性），保留减弱；而使碱性化合物离子化，保留增强（因与固定相的静电吸引）。

3. 水相中的水含量：水是HILIC中的强洗脱剂。增加水相比例会减弱保留。

四、 在极性代谢组学中的完整工作流程

1. 样品制备：采用冷乙腈或甲醇（通常样本：乙腈=1:4）沉淀蛋白。上清液直接进样，其高有机相组成与HILIC的初始流动相匹配，避免了溶剂效应，并实现了在线富集。

2. 色谱柱选择：对于全局极性代谢物分析，两性离子固定相（ZIC-HILIC）因其峰形和广泛的适用性成为

3. 质谱兼容性：使用挥发性铵盐缓冲液，与电喷雾离子源（ESI）MS/MS检测无缝对接。HILIC模式下的高乙腈含量还能显著提高ESI的离子化效率，进一步提升检测灵敏度。

综上所述，HILIC并非RPLC的替代，而是其强大的互补技术。通过理解其复杂机理并系统优化固定相和流动相，研究人员可以有效地驾驭HILIC，从而揭开强极性代谢物的神秘面纱，深入探索生命过程的化学本质。