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免疫沉淀(IP)裂解液和试剂

更新时间:2024-04-15      点击次数:987

免疫沉淀是一种能够纯化蛋白质的方法。将目标蛋白质的抗体与细胞提取物一起孵育,抗体会与溶液中的蛋白质结合。通过使用蛋白A/G偶联的琼脂糖珠将抗体/抗原复合物从样品中提取出来 。这可以将目标蛋白质与样品的其余部分分离。然后通过SDS-PAGE分离样品进行蛋白质印迹分析。


裂解缓冲液


理想的裂解缓冲液将最大限度地减少蛋白质变性,同时从样品中释放足够量的蛋白质。NP-40和Triton X-100等非离子型去污剂的刺激性低于SDS和脱氧胆酸钠等离子型去污剂。其他可能影响免疫沉淀成功的变量包括了盐浓度、二价阳离子浓度和pH值等。为了优化变量,应在以下范围内测试它们:


-盐:0-1 M


-非离子洗涤剂:0.1-2%


-离子洗涤剂:0.01-0.5%


-二价阳离子:0-10 mM


-EDTA:0-5 mM


-酸碱度:6-9


非变性裂解缓冲液


用于可溶于去污剂且可被抗体以天然形式识别的抗原。Triton X-100可以替代NP-40。


-20 mM Tris HCl pH 8


-137 mM 氯化钠


-1% Nonidet P-40 (NP-40)


-2 mM EDTA


4°C下最多可保存6个月,使用前立即添加蛋白酶抑制剂。


为方便起见可配制10%脱氧胆酸钠储备液(5g加入50mL),必须避光。


不含去垢剂的可溶性蛋白裂解缓冲液


一些可溶性蛋白质可能不需要使用洗涤剂。此缓冲液用于机械细胞裂解,例如使用杜恩斯匀浆器进行匀浆。


PBS含有:


-5mM EDTA




4°C下最多可保存6个月,使用前立即添加蛋白酶抑制剂。


非去污剂可溶性抗原的变性裂解缓冲液


仅识别变性蛋白质的抗体无法接近天然蛋白质的表位。收获和裂解细胞时,在变性裂解缓冲液中加热细胞。该方法也可用于无法用非离子去污剂从细胞中提取的抗原。使用蛋白酶抑制剂将有助于从染色质中提取蛋白质。


1% SDS


5mM EDTA


室温下最多可保存1周。


使用前立即添加


10 mM二硫苏糖醇或β-巯基乙醇


蛋白酶抑制剂15 U/mL


洗涤缓冲液


-10mM Tris;调节pH至7.4


-1mM EDTA


-1mM EGTA;pH8.0


-150mM氯化钠


-1% Triton X-100


-0.2mM原钒酸钠


-蛋白酶抑制剂混合物


4°C下最多可保存6个月。使用前立即添加蛋白酶抑制剂。


其他试剂


蛋白酶抑制剂


细胞裂解后,蛋白水解、去磷酸化和变性过程就开始了。将样品放在冰上会减慢这些过程,但也可以使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。如果不使用混合物,PMSF(50 μg/mL)和抑肽酶(1 μg/mL)是常用于免疫沉淀的蛋白酶抑制剂。


其他试剂


-无菌PBS pH 7.4


-无菌PBS-BSA 1% w/v(过滤)


-TBST缓冲液


-用于蛋白质印迹的上样/样品缓冲液


-VeriBlot用于免疫沉淀二抗,在蛋白质印迹过程中优先检测未还原、未变性 的一抗。


-100mM EDTA库存溶液由1.86gEDTA溶解在40mL H2O中制成。添加NaOH 将pH调节至7.4。最后将总体积调整至50 mL。


制备裂解物


细胞培养物裂解物(非变性)


1,将细胞培养皿置于冰上,并用冰冷的PBS清洗细胞。


2,排干PBS,然后添加冰冷的裂解缓冲液(1mL每107个细胞/100mm2培养皿 /150cm2烧瓶;0.5 mL每5×106个细胞/60mm2培养皿或75cm2烧瓶)。


3,使用冷塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下,然后将细胞悬浮液轻轻转 移至预冷的微量离心管中。


4,在4°C下保持恒定搅拌30分钟。


5,在4°C的微量离心机中离心。


您可能需要根据细胞类型改变离心力和时间。原则是12,000 rpm,20分钟, 但您应该针对您的特定实验进行优化(例如,白细胞需要非常轻微的离心)。


6,轻轻地从离心机中取出管子并置于冰上。吸出上清液并置于冰上的新管中, 并丢弃沉淀。 


细胞培养物裂解物(变性)


1,将100μL变性裂解缓冲液添加到0.5-2×107个细胞中。


2,以最大速度剧烈涡旋2-3秒充分混合。将细胞悬液转移至微量离心管中。由 于DNA的释放,溶液在此阶段可能会变得粘稠。


3,将样品加热至95°C,5分钟使其变性。


4,用0.9 mL非变性裂解缓冲液稀释悬浮液,轻轻混合。


非变性裂解缓冲液中过量1% Triton X-100会淬灭原始变性缓冲液中的SDS。


5,将裂解的悬浮液通过连接到1 mL注射器的针头5-10次,从而打碎DNA。


通过重复机械破坏,直到粘度降低。如果 DNA存在消化和片段化, 可能会干扰离心后沉淀与上清液的分离。


6,在冰上孵育5分钟。


7,继续进行免疫沉淀。


组织裂解物


1,用干净的工具尽快解剖组织。如果可能,请在冰上进行以防止蛋白酶降解。


2,将组织放入圆底微量离心管中,浸入液氮中快速冷冻。将样品储存在-80°C 下供以后使用或保存在冰上以便立即均质化。


3,对于约5 mg的组织片,将约300 μL裂解缓冲液快速添加到管中,并用电动 匀浆器匀浆。


4,每次冲洗时用另外300 μL裂解缓冲液冲洗刀片两次,然后在4°C下保持恒 定搅拌2小时(例如置于冰箱中的定轨摇床上)。


裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织量来确定。蛋白质提取物不应太稀,以避免蛋白质损失并尽量减少上样到凝胶上的样品体积。浓度0.1mg/mL;最佳浓度为1–5mg/mL。


如果需要变性样品,使用变性裂解缓冲液并执行上述变性方案中的步骤2-5。


5,在微量离心机中于4°C下以12,000 rpm离心20分钟。轻轻地将管从离心机 中取出并置于冰上,吸出上清液并置于冰上保存的新管中丢弃沉淀。


预清除裂解物


预清除裂解物有助于减少非特异性结合并降低背景。但如果蛋白质的最终检测是通过蛋白质印迹法进行,则不需要预清除,除非污染蛋白质干扰了目标蛋白质的可视化。


1,将50 μL与免疫沉淀抗体相同种类和同种型的脱靶抗体或正常血清(通常优先选择兔)添加到1 mL裂解液中。在冰上孵育1小时。


2,将100 μL珠浆添加到裂解液中。


3,在 4°C下孵育10–30分钟,并轻轻搅拌。


4,在微量离心机中于4°C以14,000 g旋转10分钟。


5,丢弃珠粒并保留上清液用于免疫沉淀。


为了提高产量,可以在裂解缓冲液中将珠子洗涤1或2次以上,并将上清液 收集在一起。


 


 


重要的是要确保尽可能多地去除正常血清。为了确保这一点,可以使用裂解缓冲液代替样品进行测试,并执行上述所有预清除步骤。


将所得上清液进行凝胶电泳并用考马斯染色显示血清Ig是否被有效去除。如果血清未充分去除,重链和轻链将出现50和25kDa的条带;它的存在可能会导致免疫沉淀反应较弱。考虑减少血清量或增加预澄清步骤中与样品一起孵育的珠子量。


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