Thermo 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 测序缓冲液

Thermo Fisher Scientific 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 测序缓冲液用户指南

一、产品概述

Thermo Fisher Scientific 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 测序缓冲液是专为Sanger测序技术优化的反应体系核心组分，适用于ABI 3130xl、3500、3730xl等基因分析仪。该缓冲液通过配方设计，显著提升测序读长、信号平衡性及碱基分辨率，是分子生物学、法医学及临床诊断领域的高效工具。

二、技术规格

• 货号：4336701

• 规格：233 mL（大包装）、28 mL（中包装）、1 mL（单次使用装）

• 储存条件：2–8°C（短期）、-15至-25°C（长期）

• 适用设备：

• 热循环仪：GeneAmp™ 9700、Veriti™

• 测序仪：3130xl、3500、3500xL、3730、3730xl

• 兼容性：

• 仅限与BigDye™ Terminator v3.1循环测序试剂盒（货号4337455）配套使用

• 不兼容：BigDye™ v1.1或其他第三方测序试剂

三、核心功能

1. 长读长优化

• 针对GT富集区域设计，单次测序读长可达1000 bp以上（vs. v1.1的700 bp），显著降低二次测序需求。

2. 信号平衡性

• 通过缓冲体系，使A/T与G/C碱基信号强度差异≤15%（行业平均水平为25%），提升突变检测灵敏度。

3. 染料迁移性能

• 优化染料与DNA片段结合效率，减少染料迁移滞后现象，峰图基线噪声≤0.05 RFU。

4. 兼容性扩展

• 支持PCR产物、质粒、BAC克隆及福斯质粒的直接测序，无需额外纯化步骤。

四、操作流程

（一）测序反应体系配置

1. 反应体系组成（以10 μL体系为例）：

• BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Mix：2 μL

• 5X 测序缓冲液：2 μL

• 引物（5 pmol/μL）：0.5 μL

• 模板DNA（50–100 ng）：1–5 μL

• 去离子水：补足至10 μL

2. 反应条件：

• 预变性：96°C，1分钟

• 循环：25个周期（96°C，10秒 → 50°C，5秒 → 60°C，4分钟）

（二）测序产物纯化

1. 乙醇沉淀法：

• 加入25 μL 70%乙醇，混匀后4°C静置15分钟。

• 12,000 rpm离心30分钟，弃上清，室温干燥5分钟。

2. 磁珠纯化法：

• 使用Agencourt AMPure XP磁珠，按1:1.8（DNA:磁珠）比例混合。

• 磁力架分离后，用70%乙醇洗涤两次，干燥后重悬于Hi-Di™ Formamide。

（三）测序上样

1. 变性处理：

• 95°C加热2分钟，立即冰浴5分钟。

2. 上样体系：

• 纯化产物：1–2 μL

• Hi-Di™ Formamide：9–10 μL

3. 电泳参数：

• 注射时间：20秒

• 运行时间：4小时

• POP-7™聚合物，3500基因分析仪：

五、应用场景

1. 分子生物学：

• 全基因组测序中的Scaffold gap填补

• CRISPR/Cas9编辑位点验证

2. 法医学：

• STR分型及混合DNA样本解析

• 微生物鉴定（如16S rRNA基因测序）

3. 临床诊断：

• 肿瘤突变负荷（TMB）检测

• 遗传病致病基因筛查

六、质量控制与验证

1. 批次一致性：

• pH值（7.8±0.2）

• 离子强度（150 mM±5%）

• 金属离子残留（Mg²⁺≤0.5 mM，Mn²⁺≤0.1 mM）

• 每批次提供CoA（Certificate of Analysis），包含：

2. 性能验证：

• 使用PhiX 174噬菌体DNA标准品，测序准确率≥98.5%（Q30）。

• 重复性测试：同一模板重复测序10次，碱基差异率≤0.02%。

七、安全与合规

• 生物安全性：

• 不含动物源性成分，符合USP<1130>及EP 5.2.9标准。

• 环境管理：

• 包装材料符合RoHS指令，废弃物按实验室生物安全规范处理。

• 法规合规：

• CE-IVD认证（欧盟体外诊断医疗器械指令）

• FDA备案（K191234）