Thermofisher Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854)

Thermofisher Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854) 用户指南：高灵敏度核酸定量技术方案

一、产品核心特性与检测原理

1. 技术背景与试剂盒组成

• 检测原理：基于荧光染料特异性结合双链DNA（dsDNA）的特性，通过PicoGreen染料与dsDNA结合后荧光信号增强数千倍，实现高灵敏度定量。

• 试剂盒组成：

• DSDNA HS Assay Reagent（试剂A）：200×浓缩液（1.25 mL），含PicoGreen染料；

• DSDNA HS Assay Buffer（缓冲B）：250 mL，用于稀释样品与试剂；

• 标准品1（C组份）：0 ng/μL dsDNA（TE缓冲液）；

• 标准品2（D组份）：10 ng/μL dsDNA（TE缓冲液）。

• 兼容性：适用于Qubit 2.0/3.0/4.0荧光计及荧光酶标仪，支持单次检测1-20 μL样品。

2. 性能指标与优势

• 灵敏度：可检测低至0.2 ng/μL（200 pg/mL）的dsDNA，线性范围10 pg/μL至100 ng/μL；

• 特异性：对dsDNA的选择性＞99%，不受ssDNA、RNA、蛋白质或盐离子干扰；

• 准确性：与qPCR结果相关性R²＞0.99，CV值＜5%（50次重复实验）；

• 抗污染性：耐受1% SDS、500 mM NaCl、1 mg/mL BSA等常见污染物。

二、典型应用场景与实验方案

1. NGS文库定量与质控

• 实验设计：

1. 提取DNA后，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit定量文库浓度；

2. 稀释文库至推荐浓度（如Illumina平台需2-10 nM），结合Qubit结果与Agilent 2100生物分析仪检测片段分布。

• 结果示例：

• 定量某NGS文库，Qubit检测浓度为4.5 ng/μL（约2.8 nM），Agilent 2100显示主峰位于350 bp，符合预期；

• 对比紫外分光光度计（Nanodrop）结果，Qubit浓度低15%，因Nanodrop高估了RNA与蛋白质污染。

2. 临床样本DNA定量

• 实验设计：

1. 提取患者外周血或组织DNA，使用Qubit检测浓度；

2. 结合qPCR验证基因拷贝数变异（如肿瘤突变负荷检测）。

• 结果示例：

• 定量乳腺癌患者cfDNA，Qubit检测浓度为8.2 ng/μL，qPCR显示TP53突变频率为12%，与病理诊断一致；

• 对比紫外法，Qubit浓度误差率＜8%，而Nanodrop误差率达25%。

3. 微生物DNA定量

• 实验设计：

1. 提取细菌/病毒DNA，使用Qubit检测浓度；

2. 结合qPCR或数字PCR分析病原载量（如病毒载量检测）。

• 结果示例：

• 定量新冠病毒RNA提取产物，Qubit检测浓度为3.1 ng/μL（约1.9×10⁶ copies/μL），qPCR结果与之高度相关（R²=0.98）；

• 对比紫外法，Qubit检测下限低10倍，适合低载量样本。

三、操作规范与注意事项

1. 实验前准备

• 试剂配制：

1. 将试剂A与缓冲B按1:200稀释（如10 μL试剂A + 2 mL缓冲B），制备工作液；

2. 标准品1与标准品2无需稀释，直接使用。

• 仪器校准：

• 使用Qubit仪器时，选择“dsDNA HS Assay"程序，预热10分钟；

• 使用酶标仪时，设置激发波长480 nm，发射波长520 nm。

2. 检测流程

• 标准曲线建立：

1. 取200 μL工作液分别加入2支Qubit管，加入10 μL标准品1与标准品2；

2. 混匀后避光孵育2分钟，插入Qubit仪器检测，生成标准曲线。

• 样品检测：

1. 取200 μL工作液加入Qubit管，加入1-20 μL样品（建议体积1 μL）；

2. 混匀后孵育2分钟，检测并记录浓度。

3. 实验后处理

• 废弃物处理：

• 含染料的废弃液按生物危害品处理，避免直接排放；

• 未使用的标准品与工作液可4℃保存1周，但建议现用现配。

• 仪器维护：

• Qubit管使用后立即丢弃，避免重复使用；

• 酶标仪定期清洁光路，避免染料残留。

四、常见问题解答

Q1：Qubit检测结果与qPCR差异较大？
A：

1. 检查qPCR引物特异性，避免非特异性扩增；

2. 确认Qubit检测范围（10 pg/μL-100 ng/μL），超范围样本需稀释；

3. 对比qPCR标准曲线，确认扩增效率（90%-110%）。

Q2：样品中含RNA或蛋白质如何处理？
A：

1. Qubit染料对dsDNA特异性＞99%，无需额外纯化；

2. 若需同时检测RNA，可使用Qubit RNA BR Assay Kit（货号Q32852）。

Q3：如何延长试剂盒有效期？
A：

1. 试剂A避光保存于-20℃，避免反复冻融；

2. 缓冲B与标准品4℃保存，避免高温或光照；

3. 开封后试剂盒6个月内使用完毕。