556547 FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒用户指南

556547 FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒用户指南

——精准检测细胞凋亡的科研利器

一、产品概述

556547 FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒（货号：556547）由美国BD公司（BD Biosciences）研发，基于Annexin V与磷脂酰丝氨酸（PS）的高亲和力特性，通过FITC荧光标记实现凋亡细胞的早期识别。该试剂盒适用于流式细胞术（FCM），可区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡/坏死细胞，是细胞凋亡研究的经典工具。

二、技术规格

• 包装规格：100测试/盒

• 储存条件：2–8℃（短期）、-20℃（长期，避免反复冻融）

• 有效期：12个月（自生产日期起）

• 核心组分：

• Annexin V Binding Buffer（10×）：含HEPES、NaCl、CaCl₂，用于维持PS外翻的离子环境。

• FITC Annexin V：分子量35–36 kDa，Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与暴露的PS结合。

• Propidium Iodide（PI）：核酸染料，仅能透过晚期凋亡/坏死细胞的细胞膜。

三、核心优势

1. 高灵敏度

• FITC Annexin V可检测PS外翻这一凋亡早期事件，早于DNA断裂等核变化。

• 在Jurkat细胞凋亡模型中，可检测到0.5%的早期凋亡细胞。

2. 多阶段区分

• 活细胞：Annexin V⁻/PI⁻

• 早期凋亡：Annexin V⁺/PI⁻

• 晚期凋亡/坏死：Annexin V⁺/PI⁺

• 通过Annexin V与PI的联合染色，可区分：

3. 操作简便

• 无需固定细胞，15分钟孵育即可完成染色，适配高通量筛选。

四、操作流程

（一）样本准备

1. 细胞收集：

• 悬浮细胞：1000 rpm离心5分钟，弃上清。

• 贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化，2000 rpm离心5–10分钟，弃上清。

2. 洗涤：

• 用预冷的1×PBS（pH 7.4）重悬细胞，2000 rpm离心5分钟，重复1次。

3. 浓度调整：

• 用1×Annexin V Binding Buffer调整细胞浓度至1×10⁶细胞/mL。

（二）染色

1. 试剂添加：

• 5 μL FITC Annexin V

• 5 μL PI（20 μg/mL）

• 取100 μL细胞悬液至流式管中，加入：

2. 孵育：

• 室温避光孵育15分钟。

3. 稀释：

• 加入400 μL 1×Annexin V Binding Buffer，轻柔混匀。

（三）流式检测

• 参数设置：

• FITC通道（Ex/Em：494/518 nm）检测Annexin V

• PerCP/Cy5.5或ECD通道检测PI

• 结果分析：

• Annexin V⁻/PI⁻：活细胞

• Annexin V⁺/PI⁻：早期凋亡细胞

• Annexin V⁺/PI⁺：晚期凋亡/坏死细胞

五、应用案例

1. 肿瘤研究

• 在乳腺癌细胞系（MCF-7）中，通过该试剂盒检测到紫杉醇处理后早期凋亡细胞比例从5%升至35%。

2. 免疫学研究

• 发现T细胞活化后48小时，Annexin V⁺/PI⁻细胞比例显著增加，提示凋亡早期事件。

3. 药物毒性评估

• 在肝细胞（HepG2）中，检测到顺铂处理后晚期凋亡/坏死细胞比例从2%升至28%。

六、质量控制与验证

1. 批次一致性：

• Annexin V活性（≥95%）

• FITC荧光强度（CV≤5%）

• PI纯度（HPLC验证≥99%）

• 每批次试剂盒附带CoA（Certificate of Analysis），包含：

2. 性能验证：

• 使用Jurkat细胞系进行重复性测试（n=10），早期凋亡细胞检测CV≤3%。

七、注意事项

1. 操作安全：

• FITC和PI为光敏物质，需避光操作。

• PI有毒性，操作时需佩戴手套，避免接触皮肤和黏膜。

2. 样本处理：

• 避免过度消化贴壁细胞，推荐用不含EDTA的胰酶处理。

• 血液样本需去除血小板，因其含PS可干扰结果。

3. 检测时效：

• 染色后宜在1小时内完成流式检测，时间过长可能导致凋亡率偏高。